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荧光法测定小麦胚中的谷胱甘肽

 

荧光法测定小麦胚中的GSH,其原理是谷胱甘肽在pH8的碱性条件下,与邻苯二甲醛作用形成1:1的络合物,该络合物在紫外光照射下会发生蓝色荧光,然后用荧光分光光度仪进行测定。

主要材料和仪器设备

材料

  • 谷胱甘肽(GSH),纯度大于99%。
  • 邻苯二甲醛,进口分装。
  • 甲醇,AR级。
  • 偏磷酸(HP03),AR级。

仪器设备

  • RF-5000型荧光分光光度仪。
  • PHS-2C型酸度计。
  • HSC-20R高速离心机。
  • 微孔过滤器。

测定方法

  1. 邻苯二甲醛溶液的配制:将50mg邻苯二甲醛溶解在甲醇中配制成质量分数0.1%的邻苯二甲醛甲醇溶液,然后放入5R的冰箱中备用。
  2. 标准样液的配制:精确称取谷胱甘肽标样1000mg,用去离子水定容到100ml,再分别吸取0.50,1.00,2.00,3.00,4.00ml于5个100ml容量瓶中,分别用去离子水定容至刻度。通常标准样液在使用前配制。
  3. 样品的预处理:精确称取已粉碎的小麦胚10g,移入100ml容量瓶中,加去离子水定容至刻度,然后离心分离,在上清液中加入10ml质量浓度为250g/L的HP03溶液,10min后离心分离,将上清液再用微孔过滤膜过滤,所得滤液供下面络合反应用。
  4. 络合反应:在室温条件下,用移液管吸取2.00ml样液于比色管中,再用另一支移液管吸取2ml邻苯二甲醛液,再加入2ml0.5mol/L磷酸缓冲液(pH8.0),于暗处反应1min后测定其荧光强度。

结果与讨论

1、最佳波长的选择

取5ml质量浓度为40mg/L的GSH溶液与5ml邻苯二甲醛溶液反应,再加入5ml0.5mol/L磷酸缓冲液(pH8.0),1min后将此溶液放入荧光分光光度计中进行发射波长和激发波长的扫描,结果最大吸收波长分别是激发波长EX:340nm,发射波长EM:420nm。

2、GSH络合物的稳定性

GSH络合物在不同的贮存条件下,随着时间的延长,发生分解的程度有显著差异,因而其相对荧光强度也不同,这就对GSH测定结果的准确性有较大的影响。GSH络合物在一天之内基本上是稳定的,只是在一天之后,该络合物对光线特别敏感。因此,GSH络合物暴露在室内光线下,降解速度特别快,而在黑暗中,分解速度很缓慢’尤其在低温条件下’分解速度更慢。

3、pH值的影响

当pH值在6~7时,GSH络合物的相对荧光强度增加特别快,而pH值在8~12时,相对荧光强度的变化很缓慢。当pH值低于7时,相对荧光强度较弱,说明在酸性条件下不易形成GSH络合物。

结论

  1. 谷胱甘肽在PH8的条件下与邻苯二甲醛作用形成1:1的稳定络合物,利用其络合物在EX:340nm和EM:420nm荧光波长下测定小麦胚中的谷胱甘肽含量,具有操作方便、灵敏度高等优点。
  2. 本法的重现性良好,回收率高达99.87%,在0~40mg/L的浓度范围内具有良好的线性关系。

测定谷胱甘肽常用的方法有化学法和酶法,这些方法既耗时间又繁琐,准确性又不高。而我们采用荧光法对小麦胚中的GSH进行了测定,效果十分理想。

文章标签:荧光分光光度计应用谷胱甘肽小麦胚 评论收藏分享

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