荧光法测定小麦胚中的谷胱甘肽

 

荧光法测定小麦胚中的GSH，其原理是谷胱甘肽在pH8的碱性条件下，与邻苯二甲醛作用形成1:1的络合物，该络合物在紫外光照射下会发生蓝色荧光，然后用荧光分光光度仪进行测定。

主要材料和仪器设备

材料

• 谷胱甘肽(GSH)，纯度大于99%。
• 邻苯二甲醛，进口分装。
• 甲醇，AR级。
• 偏磷酸(HP03)，AR级。

仪器设备

• RF-5000型荧光分光光度仪。
• PHS-2C型酸度计。
• HSC-20R高速离心机。
• 微孔过滤器。

测定方法

1. 邻苯二甲醛溶液的配制：将50mg邻苯二甲醛溶解在甲醇中配制成质量分数0.1%的邻苯二甲醛甲醇溶液，然后放入5R的冰箱中备用。
2. 标准样液的配制：精确称取谷胱甘肽标样1000mg，用去离子水定容到100ml，再分别吸取0.50，1.00，2.00，3.00，4.00ml于5个100ml容量瓶中，分别用去离子水定容至刻度。通常标准样液在使用前配制。
3. 样品的预处理：精确称取已粉碎的小麦胚10g，移入100ml容量瓶中，加去离子水定容至刻度，然后离心分离，在上清液中加入10ml质量浓度为250g/L的HP03溶液，10min后离心分离，将上清液再用微孔过滤膜过滤，所得滤液供下面络合反应用。
4. 络合反应：在室温条件下，用移液管吸取2.00ml样液于比色管中，再用另一支移液管吸取2ml邻苯二甲醛液，再加入2ml0.5mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，于暗处反应1min后测定其荧光强度。

结果与讨论

1、最佳波长的选择

取5ml质量浓度为40mg/L的GSH溶液与5ml邻苯二甲醛溶液反应，再加入5ml0.5mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，1min后将此溶液放入荧光分光光度计中进行发射波长和激发波长的扫描，结果最大吸收波长分别是激发波长EX:340nm，发射波长EM:420nm。

2、GSH络合物的稳定性

GSH络合物在不同的贮存条件下，随着时间的延长，发生分解的程度有显著差异，因而其相对荧光强度也不同，这就对GSH测定结果的准确性有较大的影响。GSH络合物在一天之内基本上是稳定的，只是在一天之后，该络合物对光线特别敏感。因此，GSH络合物暴露在室内光线下，降解速度特别快，而在黑暗中，分解速度很缓慢’尤其在低温条件下’分解速度更慢。

3、pH值的影响

当pH值在6~7时，GSH络合物的相对荧光强度增加特别快，而pH值在8~12时，相对荧光强度的变化很缓慢。当pH值低于7时，相对荧光强度较弱，说明在酸性条件下不易形成GSH络合物。

结论

1. 谷胱甘肽在PH8的条件下与邻苯二甲醛作用形成1:1的稳定络合物，利用其络合物在EX:340nm和EM:420nm荧光波长下测定小麦胚中的谷胱甘肽含量，具有操作方便、灵敏度高等优点。
2. 本法的重现性良好，回收率高达99.87%，在0~40mg/L的浓度范围内具有良好的线性关系。

测定谷胱甘肽常用的方法有化学法和酶法，这些方法既耗时间又繁琐，准确性又不高。而我们采用荧光法对小麦胚中的GSH进行了测定，效果十分理想。