荧光光度法测定花生红衣提取物中白藜芦醇含量

 

我国花生资源极其丰富，花生红衣中含有多酚类物质——白藜芦醇。现代药理学实验证明，白藜芦醇具有抗菌消炎，降血脂，预防心血管病，抗肿瘤，抑制血小板活性等生理作用。其化学名称为3,4’,5一三羟基二苯乙烯，分子式c14H12O3，相对分子量228.2。

关于白藜芦醇的常用检测方法有HPLC、GC—MS、薄层扫描、紫外分光光度法陋3等，国内尚未见分子荧光法分析检测花生红衣提取物中白藜芦醇的报道。HPLC法实验结果准确、精度高，但步骤繁琐、耗时长、成本高；GC—MS法检测时，样品需进行衍生化处理；紫外分光光度法虽然操作简单、成本低，但检测误差较大。本文采用分子荧光法分析检测花生红衣提取物中白藜芦醇的含量。

主要试剂、仪器设备

• 花生红衣提取物：自制；白藜芦醇标准储备液：将购自sigma公司的白藜芦醇标准品(批号501—36—0)，用浓度80%的乙醇配制成96ixg/mL的溶液，储于棕色瓶中备用；实验室用水为双重蒸馏水；A1C1，等试剂均为分析纯；缓冲溶液按GB603—1988和GB604—1988进行配制。
• CayEclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)；AR2140电子天平；Gary50紫外一可见分光光度计(美国Varian公司)；奥立龙868型酸度计；KMY一500型电热鼓风干燥器。

测定方法

1、样品工作溶液的配制
在十万分之一分析天平上精确称取花生红衣提取物0.00100g，用浓度80%的乙醇溶解，并稀释至100mL，再取lmL至25mL容量瓶中，加入1mL50g/L的A1CI。溶液，然后用浓度80%的乙醇定容至刻度，摇匀。静置40min，待测定。
2、白藜芦醇标准溶液的配制
分别移取白藜芦醇标准储备液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mL至25mL容量瓶中，分别加入1mL50g/mL的A1CI，溶液，用浓度80%的乙醇定容至刻度，摇匀。静置40min，待测定。
3、测定
激发和发射光谱狭缝宽度为5.0nm，激发波长为324.06nm，发射波长为400.00nm，测定系列标准溶液中白藜芦醇的荧光强度，绘制工作曲线，然后在相同的条件下测定样品工作溶液中自藜芦醇的荧光强度，通过标准曲线方程计算其浓度。

结果与讨论

1、白藜芦醇的荧光光谱

在荧光分光光度计上选择激发和发射光谱狭缝宽度均为5.0nm，对荧光化合物的激发与发射光谱进行扫描。所得激发和发射光谱见图1。由图1可见，其激发光谱的最大峰值在324.06am处，为最大激发波长，400.00nm激发峰为溶剂瑞利散射光，可从空白液激发光谱中得到验证。其发射光谱的最大峰值在400.00nm处，为最大发射波长。

2、测定条件的选择

• A1C1，的加入量分别取1mL标准储备溶液于10mL容量瓶中，各自加入50∥L的AICl3溶液0、1、2、3、4、5mL，用浓度80%的乙醇定容至刻度。考察AICl，的加入量对荧光强度的影响。结果表明，加人1mL50g/L的AICl，溶液荧光强度最大。
• 2溶液酸度的影响分别取1mL标准储备溶液于10mL容量瓶中，加人1mL50g/L的A1C1。溶液，再各自加入1mLpH值为2、4、6、8、10、12的缓冲溶液，用浓度80%的乙醇定容至刻度。实验结果表明，样品中不加入缓冲溶液时，荧光强度最大。为此，本实验选择不加缓冲溶液。
• 静置时间对荧光强度的影响按实验方法配制的溶液静置不同的时间测定荧光强度，每隔20min测定一次，考察溶液的荧光强度随时间变化的情况。实验结果表明，溶液在静置40min后荧光强度变化较小，并在2h内保持稳定。为此本实验选择溶液静置40min进行荧光测定。

标准曲线及方法检出限

选择最大激发波长324.06nm和最大发射波长400.00nm为测定波长，对白藜芦醇系列标准溶液进行荧光测定，并绘制标准曲线。实验表明，在0～1.68×10。mol/L范围内具有良好的线性关系，其回归方程为Int(荧光强度)=18.70×C(浓度，ug/mL)+3.98，相关系数r=0.9998，说明荧光强度与相应的浓度线性显著相关。空白对照液进行11次平行测定，根据3o'/N计算，此方法的检出限为8.14×10一mmol/L。

样品测定及回收率实验

按实验方法测定花生提取物中的白藜芦醇，并对样品溶液进行平行测定，其结果见表1。

结论

采用荧光光度法检测花生红衣提取物中自藜芦醇含量的回归方程为Int(荧光强度)=18.70×C(浓度，ug/mL)+3.98，相关系数r=0.9998，检出限为8.14X10一omol/L，加标回收率95.5%.97.6%。实验中A13+与白藜芦醇形成络合物，静置40min有利于络合反应进行，增强了荧光强度的稳定性。该方法操作简单，成本低，并且准确度高，重现性好，检测结果可靠，可广泛应用于实验研究和生产过程中自藜芦醇的检测。