荧光法测定海洋生物体中石油烃总量

 

荧光分光光度法是分析海洋生物体中有害物质石油残留量方法之一，也是海洋污染生态监测推荐的方法。

荧光光谱仪器选择

本实验采用日立650-60型荧光分光光度计。它是一种专用的分子荧光分光光度计，其基本原理和荧光计相同，进入监控监测器和样品荧光检测器的信号经积分、转换、平均、数字化过滤后进入计算机处理，结果可显示在终端显示器，并由打印机打印。

溶剂和其他化学试剂

方法要求溶剂在测定范围内不能对光有吸收。本实验采用二重蒸馏水，其他试剂需经严格纯化处理，均达到分析方法的测试要求。本实验采用贻贝干样为生物样品，在实验室严格条件下保存。

样品预处理和分析步骤

生物样品经氢氧化钠皂化，用二氯甲烷萃取，残留物用石油醚溶解，于激发波长310nm,发射波长360nm处进行荧光分光光度法测定。实验进行了工作曲线制作、空白值的测定、生物内控样加标回收测定。

结果和讨论

1、选择激发波长和发射波长

打开仪器，在负高压及增益值适度的情况下，进行油标样的测试，确定激发波长310nm,发射波长360nm，激发和发射狭缝10±1nm。

2、制作工作曲线

本实验采用国际海洋考察理事会（ICES)政府海洋学委员会（I0C)的互校标准物“屈”做对比标准物。以大庆原油作标准油，实验数据经离群值检验后，制作工作曲线。实验中以最小二乘法计算得曲线斜率K =23.2，截距a=3.5,相关系数r=0.9997。测定得到油标准的线性范围为0~9.0mg/L,工作曲线的线性关系较好。

3、空白值测定

本实验中共测定六批空白样品，各为平行双样，在同天内测完。测定结果如表l所示。表l空白值的测定：

批号	ml	m2	m3	m4	m5	m6
荧光强度yl	15.8	16.9	16.8	16.4	16.8	16.2
荧光强度y2	16.6	16.3	16.4	16.9	17.2	15.9

空白样品经检验均为合格。用统计的方法算出空白样内标准差为0.372,空白总标准差为0.52，测定下限为2.05ug/L，空白上限为0.l5ug/L,最低检出限为l.89Iug/L。

4、精密度和准确度测定

实验进行了生物内控样的测定。为了验证本方法的准确度和精密度，考察整个测定过程的系统误差和偶然误差，取标准油使用液配成已知浓度的含油生物样，经皂化处理过夜，按照制作工作曲线步骤处理，在荧光分光光度计上测定其荧光强度，再换算为含油量。

• 精密度：在线性范围内测定三个浓度即三批内控样，各测六次，在2~4日内分批测完。经统计学检验，样品分析结果精密度较好，其相对标准偏差均控制在5%以内，相对误差不超过8%，重复性较好，重复性标准差为0.l42pg/L。
• 准确度 ：将标准样品外控样加标进行回收率测试，回收率测定结果在86%~l02%之间，表明本实验准确度较高。
  

5、记录和计算生物体中石油烃含量的公式

根据测得生物样品的相对荧光强度，减去空白值后，从工作曲线上查得相应石油烃的含量，按下式计算生物体中的石油烃的含量（ug/L），Woil=m·V/F·M。式中：Woil为生物体样品中石油烃的质量分数，10-6；m为从工作曲线上查得的石油烃的量，ug；V为萃取剂的体积，mL；F为样品的干/湿比；M为样品的称取量，g。

实验中干样品的保存质量对皂化效果有较大影响，对实验结果和回收率有很大影响。因为皂化效果是该方法的处理关键技术，如果皂化效果不好，萃取液会出现较严重的棕黄色，使得乳化现象严重，影响萃取的效果，从而影响测定结果。皂化萃取过程中，试剂加入的顺序、加入水的质量和数量、取样量多少、皂化时间、温度、萃取次数均是排除乳化干扰，影响萃取分层的关键。

制备生物样品时，切不可沾于瓶口和瓶壁，以免与氢氧化钠溶液接触不充分，影响皂化效果。样品预处理时，在萃取时须加入氯化钠破乳从而提高萃取效率。实验表明，氯化钠的加入量对测定结果没有明显的影响。因此，可以视水样的乳化程度加入适量的氯化钠即可。

结论

本实验采用石油醚代替环己烷，改进了《海洋监测规范》中使用环己烷作为萃取剂所存在的缺陷，保证在较高的回收效率基础上，所采用试剂对环境的影响较小。操作方法简单、快速、重复性好。

本方法满足测定实验技术指标的要求，方法灵敏度高。所建立的测定海洋生物体中芳香烃含量方法，对我国海洋调查尤为适用。因此，可在陆上实验室内建立该方法，且能实现室温皂化程序，并简单可行，基本满足海洋生物体中石油烃的测定，满足我国海洋环境监测、调查及科研的工作需参要。